細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)--EphA3+ MSCs細(xì)胞 對(duì)高濃度的IIIA4有負(fù)趨向行為
細(xì)胞趨化性（Chemotaxis，亦被稱為化學(xué)趨向性）是趨向性的一種，指細(xì)胞、細(xì)菌及其他單細(xì)胞、多細(xì)胞生物依據(jù)環(huán)境中某些化學(xué)物質(zhì)而趨向的運(yùn)動(dòng)。趨化性對(duì)細(xì)胞的發(fā)展和其他正常功能一樣不可或缺。EphA3在間充質(zhì)細(xì)胞（eMSCs）中發(fā)現(xiàn)表達(dá)，但沒(méi)有在其他的血管連接組織有表達(dá)。澳大利亞的科研人員發(fā)現(xiàn)在人間充質(zhì)細(xì)胞（MSCs）中表達(dá)的EphA3能夠在成人血管生成的早期發(fā)揮作用。在研究MSCs細(xì)胞對(duì)于血管生成的信號(hào)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中， 研究人員使用過(guò)表達(dá)EphA3的MSCs處于EphA3的一個(gè)“興奮劑”IIIA4的一個(gè)穩(wěn)定的濃度梯度中，可以觀測(cè)到過(guò)表達(dá)EphA3的MSCs對(duì)高濃度的IIIA4有負(fù)趨向行為。IIIA4是一個(gè)能使EphA3活化的抗體，研究表明IIIA4活化EphA3的MSCs減少了細(xì)胞間的聯(lián)系，從而推斷出EphA3對(duì)于MSCs的定位有著非常重要的作用。
Hypoxia-Controlled EphA3 Marks a Human Endometrium-Derived Multipotent Mesenchymal Stromal Cell that Supports Vascular Growth
C. To, R. Farnsworth, M. Vail, C. Chheang, C. Gargett, C. Murone, C. Llerena, A. Major, A. Scott and P. Janes
PloS one, 2014, 10.1371/journal.pone.0112106
一.實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：
● 倒置顯微鏡，具有10X相差物鏡和定時(shí)拍照功能
● 鏡載加熱孵育系統(tǒng)（37℃，5%CO2）
● 可選配置：全自動(dòng)載物臺(tái)，自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)
● 分析軟件：手動(dòng)分析軟ImageJ的“Manual Tracking”模塊和ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
● EphA3+ eMSC 細(xì)胞
● X-lkd IIIA4抗體
● 細(xì)胞趨化載玻片（圖一） （ibidi）
圖一，ibidi 細(xì)胞趨化載玻片圖示，如圖所示，細(xì)胞種在中間通道，兩邊的儲(chǔ)液池可以放不同的刺激因子，從中間通道的觀測(cè)可以得到細(xì)胞對(duì)刺激因子的趨向性，本例是使用一邊加入X-lkd IIIA4抗體，另外一邊放入培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，兩邊都放培養(yǎng)基作為對(duì)照組。
一.細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)
1.實(shí)驗(yàn)步驟
● 將細(xì)胞直接加入ibidi細(xì)胞趨化載玻片的中間通道中（圖二）
圖二，在觀測(cè)通道中加入細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液
● 將細(xì)胞趨化載玻片放入培養(yǎng)箱中30-35分鐘，等待細(xì)胞貼壁
● 細(xì)胞貼壁后分別在兩邊儲(chǔ)液池中加入60μl的X-lkd IIIA4抗體和無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)（+/-）（圖三）
圖三：加入X-lkd IIIA4抗體（紅色）和無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基（藍(lán)色）
● 在兩邊儲(chǔ)液池中均加入60μl的無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為空白對(duì)照（-/-）（圖四）
四：加入無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基（藍(lán)色）作為空白對(duì)照
● 按說(shuō)明，將通道加液孔塞緊后可以進(jìn)行圖像采集
● 將載玻片置入鏡載加熱孵育系統(tǒng)中，調(diào)整好采集位點(diǎn)，進(jìn)行18小時(shí)的觀測(cè)，每20分鐘采集一張圖片
一.圖像數(shù)據(jù)處理
1.手動(dòng)細(xì)胞軌跡追蹤
● 下載ImageJ，并安裝Manual Tracking模塊
● 導(dǎo)入采集的系列圖像到ImageJ中，打開(kāi)模塊“Manual Tracking”，選擇“Add track”開(kāi)始記錄細(xì)胞軌跡
● 選擇一個(gè)細(xì)胞，按照時(shí)間點(diǎn)單擊細(xì)胞，第一點(diǎn)擊后，會(huì)有新窗口跳出來(lái)顯示初始位置，以后每次點(diǎn)擊，都將在這個(gè)新窗口中產(chǎn)生一個(gè)該細(xì)胞隨著時(shí)間的新坐標(biāo)
● 統(tǒng)計(jì)完足夠的細(xì)胞軌跡后，保存軌跡坐標(biāo)表格
● 至少收集30個(gè)細(xì)胞的軌跡才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，避免同一細(xì)胞追蹤兩次，去除由于凋亡會(huì)而不能采集完整的軌跡的細(xì)胞
2）全自動(dòng)細(xì)胞軌跡追蹤
使用ibidi的WimTaxis自動(dòng)分析平臺(tái)，將采集的系列圖像上傳到該平臺(tái)，幾個(gè)工作日后，會(huì)得到細(xì)胞軌跡的坐標(biāo)表格數(shù)據(jù)結(jié)果。
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
圖五：如圖所示，在沒(méi)有趨化因子存在時(shí)，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)沒(méi)有趨向性，顯示出無(wú)序性。當(dāng)X-lkd IIIA4抗體存在時(shí)，細(xì)胞趨向遠(yuǎn)離X-lkd IIIA4抗體濃度高的區(qū)域。具有對(duì)X-lkd IIIA4抗體的負(fù)趨向性。
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