可視的細胞趨化實驗--內(nèi)皮細胞對纖溶酶原激活物和抑制物的趨化響應
細胞趨化性（Chemotaxis，亦被稱為化學趨向性）是趨向性的一種，指細胞、細菌及其他單細胞、多細胞生物依據(jù)環(huán)境中某些化學物質(zhì)而趨向的運動。趨化性對細胞的發(fā)展和其他正常功能一樣不可或缺。
在生物材料移植的時候，快速的纖維血管化是成功移植的先決條件之一。尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）和組織型纖溶酶原激活物（tPA）或纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）在纖維蛋白溶解中都發(fā)揮了重要的作用。這三種蛋白近期均被報道在無可溶纖維蛋白的細胞過程中有表現(xiàn)出獨特的作用，比如細胞粘附，遷移和增殖。
德國的科研人員發(fā)現(xiàn)使用內(nèi)皮細胞做趨化實驗，發(fā)現(xiàn)uPA，tPA和PAI-1對內(nèi)皮細胞的趨化遷移行為都有顯著的影響。
Components of the plasminogen activation system promote engraftment of porous polyethylene biomaterial via common and distinct effects.
Reichel CA, Hessenauer ME, Pflieger K, Rehberg M, Kanse SM, Zahler S, Krombach F, Berghaus A, Strieth S.
PloS one, 2015, 10.1371/journal.pone.0116883
一、實驗材料準備：
l 倒置顯微鏡，具有4X相差物鏡和定時拍照功能（Nikon）
l 鏡載加熱孵育系統(tǒng)（37℃，5%CO2）
l 可選配置：全自動載物臺，自動對焦系統(tǒng)
l 分析軟件：手動分析軟ImageJ的“Manual Tracking”模塊和ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
l HUVEC 細胞 （Human umbilical vein endothelial cells from Promocell）
l tPA，uPA，PAI-1 （Sino Biological）
l Matrigel （Corning）
l ECGM培養(yǎng)基 (Promocell）
l 細胞趨化載玻片（圖一） （ibidi）
圖一，ibidi 細胞趨化載玻片圖示，如圖所示，細胞種在中間通道，兩邊的儲液池可以放不同的刺激因子，從中間通道的觀測可以得到細胞對刺激因子的趨向性，本例是使用一邊加入uPA、tPA或PAI-1，另外一邊放入培養(yǎng)基作為實驗組，兩邊都放培養(yǎng)基作為對照組。
二、細胞趨化實驗
1）實驗步驟
l 將細胞與30%Matrigel的ECGM稀釋液混合，密度為3×106 cells/cm2，直接加入ibidi細胞趨化載玻片的中間通道中（圖二）
圖二，在觀測通道中加入細胞-基質(zhì)膠混合液
l 將細胞趨化載玻片放入培養(yǎng)箱中30-35分鐘，等待膠凝結
l 膠凝結后后分別在兩邊儲液池中加入60μl的30 ng/mL的uPA、20 ng/mL的tPA或1 μg/mL的PAI-1和無化學趨化物培養(yǎng)基作為細胞趨化實驗（+/-）（圖三）
圖三：加入X-lkd IIIA4抗體（紅色）和無化學趨化物培養(yǎng)基（藍色）
l 在兩邊儲液池中均加入60μl的無化學趨化物培養(yǎng)基作為空白對照（-/-）或均加入趨化因子為陽性對照（+/+）（圖四）
圖四：加入無化學趨化物培養(yǎng)基（藍色）作為空白對照
l 按說明，將通道加液孔塞緊后可以進行圖像采集
l 將載玻片置入鏡載加熱孵育系統(tǒng)中，調(diào)整好采集位點，進行20小時的觀測，每10分鐘采集一張圖片
三、圖像數(shù)據(jù)處理
1）手動細胞軌跡追蹤
l 下載ImageJ，并安裝Manual Tracking模塊
l 導入采集的系列圖像到ImageJ中，打開模塊“Manual Tracking”，選擇“Add track”開始記錄細胞軌跡
l 選擇一個細胞，按照時間點單擊細胞，第一點擊后，會有新窗口跳出來顯示初始位置，以后每次點擊，都將在這個新窗口中產(chǎn)生一個該細胞隨著時間的新坐標
l 統(tǒng)計完足夠的細胞軌跡后，保存軌跡坐標表格
l 至少收集30個細胞的軌跡才具有統(tǒng)計學意義，避免同一細胞追蹤兩次，去除由于凋亡會而不能采集完整的軌跡的細胞
四、實驗結果：
圖五：uPA，tPA和PAI-1對內(nèi)皮細胞的趨化遷移行為的影響。A）為在趨化因子存在下，HUVEC細胞的趨向性運動軌跡。B）為統(tǒng)計分析結果說明，HUVEC細胞對uPA，tPA和PAI-1都有證趨向行為。
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