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　　最近高分辨率成像技術(shù)的發(fā)展使研究人員能夠通過(guò)使用免疫熒光染色在其感興趣的細(xì)胞和組織中可視化亞微米級(jí)甚至納米級(jí)結(jié)構(gòu)。然而，這需要在樣品制備過(guò)程中進(jìn)行仔細(xì)對(duì)步驟進(jìn)行優(yōu)化，以便獲得清晰的圖像，并且隨著圖像分辨率的提高，方案可能會(huì)變得更加苛刻。
 

盡管各種抗體制造商都提供了“最佳”方案，但遺憾的是沒(méi)有可應(yīng)用于所有樣品類型的標(biāo)準(zhǔn)程序。事實(shí)上，大多數(shù)時(shí)候，研究人員需要通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)找到最佳工作流程。

理論上，免疫熒光染色方案包括以下六個(gè)基本步驟：固定-透化-封閉-一抗孵育-二抗孵育以及圖像采集。然而，在每一步都有許多小細(xì)節(jié)：當(dāng)以一種或另一種方式完成時(shí)，可決定您是否獲得良好的免疫熒光圖像或糟糕的圖像。
 

來(lái)自 Lewis 大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用抗兔 PCNA 抗體（以洋紅色顯示）、抗 α-微管蛋白抗體（以綠色顯示）和鬼筆環(huán)肽（以紅熱顯示）染色。使用 Leica SP8 共聚焦顯微鏡獲取圖像。

自2017年作為理學(xué)碩士學(xué)生進(jìn)入研究環(huán)境以來(lái)，我一直在研究各種類型的間充質(zhì)干細(xì)胞和胚胎組織，研究顱面再生和發(fā)育。此外，我一直沉浸在免疫熒光染色的世界中，拍攝了無(wú)數(shù)圖像，包括我的第一篇出版物（Yamada et al., 2019）《牙科研究雜志》的封面藝術(shù)。在每年花費(fèi)近300小時(shí)進(jìn)行熒光成像后，我發(fā)現(xiàn)了適合我的細(xì)胞和應(yīng)用的完美免疫熒光方案。我了解到，這里和那里的一些小調(diào)整真的會(huì)有所作為！

在本文中，我將分享我的前5個(gè)基本但經(jīng)常被忽視的優(yōu)化步驟，這些步驟將改善您的免疫熒光細(xì)胞圖像。

　　1. 了解您的目標(biāo)蛋白并確定固定方案

首先要考慮的關(guān)鍵因素是決定為您的樣品使用哪種固定劑。各種固定劑，包括醛類（例如，多聚甲醛：PFA）、酒精（例如，冰冷的甲醇）和酸基溶液（例如，三氯乙酸）已顯示出與免疫熒光出色的相容性，但是這些固定劑中的每一種都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。PFA和甲醇是很好的選擇。您可以在文獻(xiàn)中了解它們?cè)诠潭ㄌ匦苑矫娴牟町悾ɡ鏓ldred et al., 1983）。

無(wú)論您選擇哪種固定劑，優(yōu)化固定時(shí)間至關(guān)重要。應(yīng)避免過(guò)度固定，因?yàn)樗鼤?huì)對(duì)細(xì)胞造成破壞性影響并惡化抗體識(shí)別（圖 1A）。然而，人們也應(yīng)該避免固定不足，因?yàn)樗试S您的靶向蛋白質(zhì)從其天然位點(diǎn)移動(dòng)并擴(kuò)散到“外部世界”。這不僅會(huì)導(dǎo)致模糊圖像，還會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性染色。

時(shí)間很重要，溫度同樣也很重要。低溫使反應(yīng)緩慢且對(duì)細(xì)胞的破壞性較小，但它可能使蛋白質(zhì)有時(shí)候在被固定之前四處移動(dòng)。通常，當(dāng)使用強(qiáng)效/速效固定劑（如冰冷的甲醇）時(shí)，優(yōu)選在低溫下固定。對(duì)于較溫和的固定劑，如PFA，在環(huán)境溫度下固定可能更合適，至少對(duì)于單層細(xì)胞。

我曾經(jīng)盲目地遵循“4% PFA 室溫 15 分鐘”的規(guī)則，但后來(lái)我發(fā)現(xiàn)我的樣品固定不足，浪費(fèi)了很多時(shí)間和資源。這可能不會(huì)經(jīng)常發(fā)生，但它會(huì)發(fā)生。如有疑問(wèn)，請(qǐng)仔細(xì)檢查您的固定方案！

圖 1A：過(guò)度固定的示例。甲醇在室溫下使用 15 分鐘。紅色和細(xì)胞核中的α-微管蛋白，藍(lán)色的 DAPI

圖 1B：正確固定細(xì)胞的示例： -20 度冰冷的甲醇 5 分鐘。紅色的 α-微管蛋白和藍(lán)色的細(xì)胞核 *DAPI

　　2. 確定使用哪種洗滌劑以及何時(shí)使用（或不使用）

當(dāng)需要透化時(shí)，非離子去污劑（例如，Triton X-100 和 Tween-20）通常不僅包含在透化緩沖液中，而且還經(jīng)常包含在封閉緩沖液、洗滌緩沖液和染色緩沖液中。這是因?yàn)槿ノ蹌┑氖褂脤?shí)際上提高了封閉效率，并在洗滌步驟中去除了非特異性抗體結(jié)合。但是，如果您的靶向蛋白（尤其是在細(xì)胞膜或細(xì)胞骨架上）在您的圖像中顯示的數(shù)量低于您的預(yù)期，則洗滌劑可能會(huì)干擾免疫染色。

Triton X-100 和 Tween-20 具有不同的化學(xué)特性，但最重要的是，Triton X-100 比 Tween-20 更強(qiáng)大地滲透細(xì)胞膜。如果在透化步驟中使用 Triton X-100，您可以選擇是繼續(xù)在洗滌、封閉和染色緩沖液中使用 Triton X-100，還是改用 Tween-20，甚至繼續(xù)沒(méi)有任何清潔劑?；蛘?，您可能只想使用 Tween-20 進(jìn)行滲透。最后，不要忘記有時(shí)您根本不需要清潔劑。

　　3. 濃度低，但孵化時(shí)間長(zhǎng)

使用最少量的抗體對(duì)于提高信背比極為重要。我總是建議使用抗體滴定來(lái)確定最低工作濃度，即使制造商可能會(huì)提出最佳濃度。通常，與高抗體劑量的較短孵育時(shí)間相比，低抗體濃度的較長(zhǎng)孵育時(shí)間（例如，4°C，過(guò)夜）提供更清晰、更強(qiáng)和更特異性的染色模式?？贵w滴定有時(shí)很費(fèi)力，需要額外的資源和時(shí)間，但一旦確定了最佳工作濃度，您就不會(huì)后悔。

　　4. 洗 洗 洗

洗滌可能是免疫熒光染色過(guò)程中最重要的步驟。相信我，一個(gè)人永遠(yuǎn)不會(huì)后悔額外的洗滌步驟！只要使用高質(zhì)量的抗體，抗原-抗體結(jié)合就足夠強(qiáng)，可以承受“額外的”洗滌步驟，同時(shí)有效去除弱結(jié)合或非特異性結(jié)合的抗體。一個(gè)微弱的低語(yǔ)可能即將從你的嘴唇中發(fā)出，“它既費(fèi)時(shí)又單調(diào)。”我知道，但洗滌確實(shí)讓您的形象從好到更好！多增加一兩個(gè)洗滌步驟，讓您有時(shí)間享用一杯茶。

　　5. 找到合適的光學(xué)設(shè)備

最后但并非最不重要的一點(diǎn)是，只有在所有光學(xué)系統(tǒng)都得到很好的優(yōu)化后，才能捕捉到圖像中的精細(xì)細(xì)節(jié)。如果您從事攝影，您可能會(huì)意識(shí)到高端鏡頭通常比相機(jī)（例如傳感器系統(tǒng)）本身更昂貴。這僅僅是因?yàn)樵诰懿ＡШ屯繉拥拈_(kāi)發(fā)上花費(fèi)了如此多的資源和如此多的時(shí)間。可以說(shuō)，這些鏡頭的質(zhì)量決定了圖像的質(zhì)量。同樣的理論也適用于微觀系統(tǒng)。顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)是最終圖像質(zhì)量的關(guān)鍵決定因素。有趣的事實(shí)：這是顯微鏡制造商為了提升他們的技術(shù)而激烈競(jìng)爭(zhēng)的組件！

現(xiàn)在我能聽(tīng)到你說(shuō)，“我們不能改變顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。”實(shí)際上，您可以更改某些東西，這將極大地影響成像結(jié)果，而與您的技術(shù)設(shè)備無(wú)關(guān)：用于培養(yǎng)或放置細(xì)胞和樣品的蓋玻片或成像室！這些由薄玻璃或塑料制成的組件對(duì)人眼是完全透明的，但它們中的每一個(gè)：光/激光通過(guò)的地方，都會(huì)顯著影響最終的成像結(jié)果，就像它們是光學(xué)系統(tǒng)的一部分一樣。

這就是 ibidi µ-Slides 發(fā)揮作用的地方！ ibidi µ-Slide 腔室和蓋玻片的開(kāi)發(fā)具有出色的光學(xué)質(zhì)量，適用于高分辨率顯微鏡，因?yàn)樗鼈兊纳w玻片底部很薄。對(duì)于細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)高分辨率成像（例如，相差、共焦或 2 光子），強(qiáng)烈建議使用細(xì)胞培養(yǎng)處理 (ibiTreat) polymer版，其 No. 1.5蓋玻片厚度為 180 µm，而 µ-Slides #1.5H 玻璃底部 (170 µm +/-5 µm) 的載玻片非常適合 TIRF 和超分辨率顯微鏡應(yīng)用。

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