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　　1、哪種細(xì)胞密度最適合我的實(shí)驗(yàn)？

　　通常，我們建議每孔使用5,000-10,000個(gè)HUVEC。 但是，確定最佳細(xì)胞數(shù)對(duì)于使用µ-Slide血管生成從管形成測(cè)定中獲得最佳結(jié)果是至關(guān)重要。 細(xì)胞密度取決于細(xì)胞類(lèi)型和細(xì)胞大小。 因此，在開(kāi)始實(shí)際實(shí)驗(yàn)之前，我們建議在非抑制條件下播種幾個(gè)細(xì)胞數(shù)并對(duì)管形成進(jìn)行成像。 然后，對(duì)于最佳測(cè)定條件，使用在您的實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生最多管數(shù)的細(xì)胞密度。請(qǐng)記住，細(xì)胞通常不會(huì)在凝膠基質(zhì)上增殖。請(qǐng)參閱：血管生成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)裝置優(yōu)化和數(shù)據(jù)分析 |ibidi µ-Slide

　　2、應(yīng)該在哪個(gè)時(shí)間段內(nèi)觀察細(xì)胞？

　　管形成的持續(xù)時(shí)間取決于細(xì)胞類(lèi)型和所使用的細(xì)胞外基質(zhì)，應(yīng)單獨(dú)確定。 通常，HUVEC在 2-4小時(shí)后已經(jīng)形成管。24小時(shí)后細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生凋亡，這導(dǎo)致從基質(zhì)中脫離和管破裂。請(qǐng)參閱：血管生成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)裝置優(yōu)化和數(shù)據(jù)分析 |ibidi µ-Slide

　　3、是否需要活細(xì)胞成像裝置來(lái)每小時(shí)拍攝管形成測(cè)定的照片？

　　非必須，通過(guò)顯微鏡對(duì) µ-Slide 血管生成上的同一位置進(jìn)行一致和精確的成像。 可以使用顯示 x/y 坐標(biāo)的顯微鏡載物臺(tái)或自動(dòng)載物臺(tái)來(lái)完成成像。 使用自動(dòng)化平臺(tái)，可以將孔的所有位置（特別是每個(gè)孔的中心）保存到位置列表中，您可以在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)訪問(wèn)相應(yīng)的位置。

　　但是，使用完整的活細(xì)胞成像設(shè)置在顯微鏡上建立生理?xiàng)l件要方便得多。使用ibidi Stage Top 孵育系統(tǒng)等活細(xì)胞孵育裝置有助于在成像過(guò)程中提供穩(wěn)定溫度和濕度條件，從而在體外可以直接進(jìn)行視頻拍攝。

　　4、是否可以使用 µ-Slide 血管生成在凝膠基質(zhì)內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞？

　　可以，µ-Slide 血管生成非常適合在精確定義的3D基質(zhì)中培養(yǎng)細(xì)胞。由于大界面的凝膠和頂部細(xì)胞培養(yǎng)基，凝膠中的條件可以通過(guò)更換上部?jī)?chǔ)液器中的介質(zhì)來(lái)調(diào)整。

　　5、應(yīng)該在管形成實(shí)驗(yàn)中使用含酚紅的凝膠還是不含酚紅的凝膠？

　　對(duì)于使用µ-Slide血管生成的管形成測(cè)定中的相差顯微鏡，酚紅不會(huì)干擾圖片，并且由于其顏色，處理更容易。然而，當(dāng)使用熒光顯微鏡時(shí)，酚紅可能會(huì)干擾探頭的波長(zhǎng)。在這種情況下，最好使用無(wú)酚紅凝膠。

　　6、是否需要將µ-Slide Angiogenesis血管生成載玻片放入培養(yǎng)箱的濕室中進(jìn)行凝膠聚合？

　　我們建議將µ-Slide血管生成載玻片放入加濕腔中進(jìn)行凝膠聚合。 雖然反應(yīng)室對(duì)于聚合本身不是必需的，但它可以最大限度地減少蒸發(fā)的影響。 在高流量孵化器中，防止蒸發(fā)的足夠百分比的濕度可能不會(huì)始終保持一致。 µ-Slide血管生成中的少量凝膠會(huì)很快變干，這會(huì)導(dǎo)致彎液面的形成。

　　7、胎牛血清 (FBS) / 胎牛血清 (FCS) 濃度是否會(huì)影響管形成實(shí)驗(yàn)中的管形成和降解速率？

　　一般是的。 這取決于所使用的細(xì)胞類(lèi)型或細(xì)胞系。 當(dāng)提供濃度高達(dá) 10% FCS 的細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，我們?cè)?µ-Slide 血管生成中觀察到典型的原代細(xì)胞 (HUVEC) 管形成和 Matrigel® 上的幾種內(nèi)皮細(xì)胞系。 但是，我們建議分別優(yōu)化每個(gè)細(xì)胞系的 FBS/FCS 濃度。

　　8、您是否推薦使用減少生長(zhǎng)因子的 Matrigel® 進(jìn)行管形成分析？

　　對(duì)于使用µ-Slide血管生成的管形成測(cè)定，我們使用了減少生長(zhǎng)因子的 Matrigel® 和未減少的 Matrigel®。請(qǐng)參閱：腫瘤學(xué)必備 | 血管生成實(shí)驗(yàn)介紹

　　9、我們希望使用減少了生長(zhǎng)因子的 Matrigel® 和無(wú)血清培養(yǎng)基以及 50 ng/ml VEGF。 這足以刺激管的形成嗎？

　　可以，這種組合足以刺激ibidi血管生成實(shí)驗(yàn)室器皿中的管形成，而培養(yǎng)基中沒(méi)有任何額外的生長(zhǎng)因子。

　　10、除了 Matrigel® 之外，您在試管形成實(shí)驗(yàn)中是否有使用其他凝膠的經(jīng)驗(yàn)？

　　原則上，任何凝膠都可用于µ-Slide血管生成管形成實(shí)驗(yàn)。 細(xì)胞可以附著在表面上是很重要的。 膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白為細(xì)胞粘附提供了重要的結(jié)合基序。

　　11、什么是管形成實(shí)驗(yàn)合適的陽(yáng)性和陰性對(duì)照？

　　建議使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照來(lái)減少管形成實(shí)驗(yàn)中的變量。陽(yáng)性對(duì)照是預(yù)期細(xì)胞在其中形成血管的樣本（取決于實(shí)驗(yàn)設(shè)置），從而向研究人員表明該實(shí)驗(yàn)已正確進(jìn)行。陰性對(duì)照是與所有其他樣品以相同方式處理的樣品，但預(yù)計(jì)不會(huì)顯示任何實(shí)驗(yàn)結(jié)果（例如，很少或沒(méi)有管形成）。

　　ibidi血管生成實(shí)驗(yàn)室器皿中管形成實(shí)驗(yàn)的最佳陽(yáng)性和陰性對(duì)照很大程度上取決于所使用的細(xì)胞、凝膠基質(zhì)和一般實(shí)驗(yàn)設(shè)置。因此，我們建議您查閱文獻(xiàn)，了解您感興趣的主題中成功使用的對(duì)照（陽(yáng)性和陰性對(duì)照）。

　　在下文中，您可以找到管形成測(cè)定中陽(yáng)性和陰性對(duì)照的可能方法：

　　如果需要分析特定化合物誘導(dǎo)血管生成的效力，則可以使用用已知血管生成誘導(dǎo)劑（例如 VEGF 或 FGF2）處理的樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。濃度很大程度上取決于細(xì)胞類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)設(shè)置。

　　如果使用原代細(xì)胞，預(yù)篩選的內(nèi)皮細(xì)胞系（例如，HUVEC）在用特定生長(zhǎng)因子處理后表現(xiàn)出明確的反應(yīng)，可以作為陽(yáng)性對(duì)照。

　　對(duì)于某些細(xì)胞類(lèi)型，形成管的能力還取決于所使用的凝膠基質(zhì)。作為陽(yáng)性對(duì)照，內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)在含有饑餓培養(yǎng)基（不含生長(zhǎng)因子或血清的培養(yǎng)基）的生長(zhǎng)因子減少的 Matrigel®上顯示管形成。如果需要測(cè)試促血管生成物質(zhì)，則使用饑餓培養(yǎng)基尤其重要，因?yàn)榇蠖鄶?shù)細(xì)胞培養(yǎng)基都添加了生長(zhǎng)因子。為了分析物質(zhì)的真實(shí)效果，基質(zhì)和培養(yǎng)基都必須不含任何生長(zhǎng)因子。作為陰性對(duì)照，細(xì)胞可以播種在不同的基質(zhì)（例如膠原蛋白 I）上，預(yù)計(jì)不會(huì)形成管狀。

　　不影響細(xì)胞活力的管形成抑制劑（例如，蘇拉明或蘿卜硫素）可用作陰性對(duì)照。如果實(shí)驗(yàn)的目的是測(cè)試抗血管生成物質(zhì)，則使用這種類(lèi)型的抑制劑尤其重要。

　　如果用任何溶解的物質(zhì)（例如，在 DMSO 或乙醇中）處理細(xì)胞，則僅使用溶劑作為陰性對(duì)照。

　　12、是否有用于分析管形成實(shí)驗(yàn)的推薦染色方案？

　　一般來(lái)說(shuō)，相差顯微鏡足以自動(dòng)分析 µ-Slide血管生成中的標(biāo)準(zhǔn)管形成實(shí)驗(yàn)。 但是，如果您想研究某種標(biāo)記，您可以應(yīng)用您的標(biāo)準(zhǔn)方案（例如，用于免疫熒光染色），但要小心，以免損壞凝膠基質(zhì)或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。

　　使用calcein的染色方案示例可參閱：腫瘤學(xué)必備 | 血管生成實(shí)驗(yàn)介紹

　　13、在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，我是否必須將 ibidi 血管生成實(shí)驗(yàn)室器皿平衡到 37°C？

　　不，不需要平衡 µ-Slide 血管生成。 在室溫下儲(chǔ)存，可以立即用凝膠基質(zhì)填充。 由于µ-Slide 的開(kāi)孔形式，加熱時(shí)從凝膠中逸出的氣體可以與大氣自由交換。

　　14、完成實(shí)驗(yàn)后，µ-Slide Angiogenesis和µ-Plate Angiogenesis 96 Well可以重復(fù)使用嗎？

　　不可以，µ-Slide血管生成載玻片和µ-Plate血管生成96孔板是一次性耗材，僅供一次性使用。

　　15、µ-Slide 血管生成是否有96孔版的？

　　有。 µ-Plate血管生成96孔板具有與µ-Slide血管生成相同的“孔中孔”設(shè)計(jì)和凝膠體積 (10 µl)。 µ-Plate血管生成96孔可用作高通量管形成實(shí)驗(yàn)的篩選板，具有完全的ANSI/SLAS (SBS) 和robotics兼容性。