date:2023-11-16 13:10:22
細胞趨化實驗原理
定義：趨化性（Chemotaxis，亦被稱為化學趨向性）是趨向性的一種，指身體細胞、細菌及其他單細胞、多細胞生物依據環(huán)境中某些化學物質而趨向的運動。這對細菌尋找食物 (如葡萄糖) 十分重要，細菌以此趨進有較高食物分子濃度的地方，或遠離有毒 (如苯酚) 的地方。在多細胞生物中，趨化性對其發(fā)展和其他正常功能一樣不可或缺。正趨化性指趨向較高化學物質濃度的運動，而負趨化性則相反。
下面，我們介紹一個使用ibidiμ-Slide Chemotaxis3D分析嵌入3D牛膠原蛋白基質中的小鼠樹突狀細胞的趨化性的詳細實驗方案。
使用ibidiμ-Slide Chemotaxis細胞趨化載玻片的化學趨化實驗，可以實時觀察記錄細胞的趨化行為。
一、實驗材料準備
1）儀器：
細胞培養(yǎng)箱（高濕度，37℃，5%CO2）
帶定時拍照功能的倒置相差顯微鏡
鏡載加熱孵育系統(tǒng)（37℃，5%CO2）
可選配置：全自動載物臺，自動對焦系統(tǒng)（x，y，z），可平行觀察3個腔室和多達4個玻片。
分析軟件：ImageJ插件“手動跟蹤”和“ibidi的趨化和遷移工具
注意：低倍率物鏡（4x-10x）提供了更大的聚焦深度，因此是有利的。
2）樹突細胞的培養(yǎng)：
樹突狀細胞(第8-10天)應用200 ng/ml LPS(在細胞培養(yǎng)基中，如表1所示)過夜激活。
表一：樹突細胞培養(yǎng)所需的試劑和培養(yǎng)基
3）基質膠制備，Collagen I，bovine，1.6mg/ml
樹突狀細胞的化學趨化實驗所需的耗材和試劑（如下表二）：
表二：化學趨化需要的耗材和試劑
表三：1.5 mg/ml牛膠原蛋白I凝膠的組成
操作步驟：
?、?使用表一中的培養(yǎng)基制備9 x 106 cells/ml的細胞懸液
② 在1.5ml離心管中小心混勻表三中的成分1，2，3和4，避免產生氣泡
?、?在另一1.5ml離心管中準備150μl的膠原蛋白（成分5）
④ 使用200μl槍頭將步驟2中的100µl混合物轉移到膠原蛋白管中（圖一A）
?、菪⌒幕靹颍▓D一B），務必避免產生氣泡
?、?向混合液中加入50μl細胞懸液（圖一C）
?、?小心混勻（圖一D），務必避免產生氣泡
⑧ 隨后，立即將混合物填充到通道中
?、?將載玻片放入培養(yǎng)箱45分鐘使其凝固。之后，膠原纖維就會顯現(xiàn)出來。
二、細胞趨化實驗
1）趨化試劑：
化學趨化物：CCL19 (1.25 µg/ml in RPMI 1640 supplemented with 10%FCS)
無化學趨化物培養(yǎng)基：RPMI 1640 supplemented with 10% FCS
操作步驟：
?、?凝膠凝膠化后，用不含化學趨化物或含化學趨化物的培養(yǎng)基加入細胞趨化載玻片的儲液池中。
?、?用65µl含有化學趨化物的培養(yǎng)基填充一個儲液池，用65μl無化學趨化物培養(yǎng)基填充另一個儲物池作為細胞趨化實驗（+/-）。
?、?作為對照實驗（-/-），用65µl無化學趨化物培養(yǎng)基填充兩個儲液池。
?、?按說明，將通道加液孔用塞子塞緊后可以進行圖像采集。
?、?將載玻片置入鏡載加熱孵育系統(tǒng)中。
?、?調整好采集位點，進行4小時的觀測，每2分鐘采集一張圖片。
圖1.顯微鏡觀察：由于3D環(huán)境，并非所有細胞都能完全聚焦，這取決于所使用的物鏡
三、實驗結果
如果滿足以下參數(shù)并具有統(tǒng)計學相關性，則可以假設細胞定向遷移:
1）趨化實驗的FMIII值大于fmii值，且p值<0.05;
2）各對照實驗的FMIII和fmil應在零左右，p值應為p>0.05。
表四：HT1080細胞遷移參數(shù)比較。趨化性實驗和對照實驗的數(shù)據如下表所示。CCL19作為化學趨化物
當使用CCL19作為化學引誘劑時，可觀察到趨化反應。趨化實驗的FMIII和p值(瑞利檢驗的p值)都表明有定向細胞遷移。相反，在沒有CCL19(對照實驗)的情況下，可以觀察到隨機遷移。
圖2. 在1.5mg/ml膠原凝膠中培養(yǎng)的樹突狀細胞的代表性細胞軌跡圖。給出了趨化性實驗（a）和對照實驗（b）的結果
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